Saat Anda baru saja lulus dan memasuki pekerjaan, Anda dihadapkan pada sekumpulan kata benda yang menghadapi eksperimen PCR kuantitatif waktu nyata. Apakah Anda bingung harus mulai dari mana? Apa arti dari kurva amplifikasi, kurva standar, ambang batas, nilai CT, kurva leleh dan garis dasar? Gambar berpendar dari percobaan itu terlalu terang, tapi sepertinya saya tidak bisa mengidentifikasinya. Hari ini, kami akan mengajak Anda mempelajari pengetahuan dan konsep ini dalam dua bagian: istilah teknis dan pertanyaan umum.
Bagian I Ketentuan Profesional
1. Kurva amplifikasi
Kurva amplifikasi mengacu pada kurva di mana nomor siklus adalah absis dan intensitas fluoresensi waktu nyata selama reaksi adalah ordinat selama PCR.
2. Dasar
Baseline mengacu pada sedikit perubahan dalam sinyal fluoresen selama beberapa siklus pertama dari reaksi amplifikasi PCR. Level sinyal menunjukkan dekat dengan garis lurus, yang merupakan garis dasar.
3. Pengaturan ambang fluoresensi
Biasanya, sinyal fluoresensi dari 15 siklus pertama reaksi PCR digunakan sebagai sinyal latar fluoresensi, dan ambang fluoresensi adalah 10 kali standar deviasi sinyal fluoresensi selama 3-15 siklus PCR, dan ambang fluoresensi diatur selama fase eksponensial amplifikasi PCR. Biasanya, setiap instrumen memiliki ambang fluoresensi sebelum digunakan.
4. Nilai CT
Nilai CT mewakili jumlah siklus yang akan terjadi pada setiap tabung reaksi PCR ketika sinyal fluoresen mencapai ambang batas yang ditetapkan. Dari penelitian diketahui bahwa terdapat hubungan linier antara nilai CT setiap template dengan logaritma nomor copy awal template tersebut. Semakin tinggi nomor salinan awal, semakin kecil nilai CT, begitu pula sebaliknya. Menggunakan standar dengan nomor salinan awal yang diketahui, kurva kalibrasi dapat dibuat di mana absis mewakili logaritma nomor salinan awal, sedangkan ordinat mewakili nilai CT. Oleh karena itu, selama nilai CT dari sampel yang tidak diketahui diperoleh, jumlah salinan awal sampel dapat dihitung dari kurva standar.
tahu lebih banyak
Ada beberapa indikator untuk menilai apakah kurva amplifikasi baik atau tidak:
Jawaban: Titik belok kurva jelas, terutama fase eksponensial dari sampel fraksi rendah-berat jelas, keseluruhan paralelisme kurva amplifikasi sangat baik, garis dasarnya datar, tidak ada fenomena naik, dan amplifikasi kurva sampel konsentrasi fase eksponensial tingkat rendah sangat baik. jelas.
B: Kemiringan fase eksponensial kurva berbanding lurus dengan efisiensi amplifikasi, semakin besar kemiringan, semakin tinggi efisiensi amplifikasi.
C: Baseline standar datar atau sedikit menurun, tanpa tren naik yang terlihat.
D: Paralelisme kurva amplifikasi untuk setiap tabung bagus, menunjukkan bahwa efisiensi amplifikasi setiap tabung reaksi serupa.
5. Kurva leleh
Ketika produk PCR dipanaskan, saat suhu naik, produk amplifikasi beruntai ganda secara bertahap berdisosiasi, menghasilkan penurunan intensitas fluoresensi. Ketika suhu tertentu tercapai, sejumlah besar produk terpisah, menghasilkan penurunan fluoresensi yang tajam. Menggunakan fungsi ini bersama dengan nilai TM yang berbeda untuk produk PCR yang berbeda juga berbeda dalam suhu di mana sinyal fluoresen menurun dengan cepat, yang mungkin merupakan cara yang baik untuk mengidentifikasi spesifisitas PCR.
6. Melting curve (menggunakan kurva logaritmik)
Grafik puncak dibentuk oleh logaritma kurva leleh untuk menampilkan situasi fragmen produk secara lebih intuitif. Karena suhu leleh adalah nilai TM fragmen DNA, parameter tertentu yang memengaruhi nilai TM fragmen DNA dapat ditentukan, seperti ukuran fragmen, kandungan GC, dll. Secara umum, menurut prinsip desain primer kami, biasanya dikatakan bahwa panjang produk yang diamplifikasi berada dalam kisaran 80-300bp, dan suhu leleh harus antara 80 derajat dan 90 derajat .
A: Jika hanya ada satu puncak utama antara 80 derajat dan 90 derajat, itu berarti PCR waktu nyata sempurna.
B: Jika puncak utama muncul antara 80 derajat dan 90 derajat, dan puncak pengotor muncul di bawah 80 derajat, primer-dimer pada dasarnya dipertimbangkan. Ini adalah opsi yang baik untuk dicoba dipecahkan dengan menaikkan suhu anil.
C: Jika puncak utama muncul antara 80 derajat dan 90 derajat, dan puncak pengembaraan muncul saat suhu meningkat, kontaminasi DNA pada dasarnya dipertimbangkan. Dan DNA perlu dihilangkan pada tahap awal percobaan.
7. Garis kurva standar
Standar standar diencerkan ke konsentrasi yang berbeda dan digunakan sebagai templat untuk reaksi PCR. Kurva standar diplot dengan logaritma nomor salinan standar sebagai absis dan nilai CT terukur sebagai ordinat. Saat mengukur sampel yang tidak diketahui, nomor salinan sampel dapat diperoleh dari kurva standar berdasarkan nilai CT dari sampel yang tidak diketahui. Kurva standar sangat penting untuk kuantifikasi absolut.
bagian kedua. masalah umum
Q1: Apa perbedaan antara RT-PCR, QPCR, real-time PCR dan real-time RT-PCR?
A1: RT-PCR adalah PCR transkripsi terbalik, yang merupakan varian reaksi berantai polimerase yang banyak digunakan. Dalam RT-PCR, untai RNA ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer, yang kemudian digunakan sebagai cetakan PCR untuk memperkuat DNA dengan PCR.
Real-time PCR dan QPCR adalah hal yang sama, keduanya adalah PCR kuantitatif waktu-nyata, artinya ada perekaman data secara real-time di setiap siklus selama proses PCR. Dengan cara ini, jumlah template startup dapat dianalisis dengan tepat.
Meskipun PCR waktu-nyata dan PCR transkripsi-balik tampaknya disingkat sebagai RT-PCR, konvensi internasionalnya adalah bahwa RT-PCR mengacu secara khusus pada PCR transkripsi-balik, sedangkan PCR waktu-nyata sering disingkat sebagai qPCR (Quantitative Real- PCR Nyata Sejati Sejati ) - waktu PCR).
Real-time RT-PCR (RT-QPCR) adalah jenis PCR transkripsi terbalik yang menggabungkan teknik kuantitatif fluoresen: transkripsi balik pertama dari RNA untuk mendapatkan cDNA (RT), diikuti dengan analisis kuantitatif menggunakan PCR waktu nyata (QPCR).
T2: Mengapa panjang fragmen produk yang diamplifikasi dari PCR kuantitatif fluoresen dikontrol dalam kisaran 80-300bp?
A2: Panjang setiap sekuens gen berbeda-beda, ada yang beberapa Kb dan ratusan BP. Namun, saat kami mendesain primer, kami hanya perlu mensyaratkan panjang produk menjadi 80-300bp, dan terlalu pendek atau terlalu panjang tidak sesuai untuk deteksi PCR kuantitatif.
Fragmen produk terlalu pendek untuk dibedakan dari dimer primer. Panjang primer-dimer sekitar 30-40bp, bila kurang dari 80bp, sulit untuk membedakan apakah itu primer-dimer atau produk. Jika fragmen produk terlalu panjang, melebihi 300bp, akan dengan mudah menyebabkan efisiensi amplifikasi rendah, dan jumlah gen tidak dapat dideteksi secara efektif.
Misalnya, ketika Anda menghitung jumlah orang di kelas, Anda hanya perlu menghitung berapa mulut yang ada. Hal yang sama berlaku saat menguji gen. Anda hanya perlu mendeteksi urutan gen tertentu untuk mewakili keseluruhan urutan. Sangat mudah membuat kesalahan jika Anda menghitung mulut dan hidung, telinga, dan kacamata untuk menghitung orang.
T3: Berapa panjang optimal untuk desain primer?
J3: Secara umum, panjang primer dalam kisaran 20-24bp bagus. Tentunya kita harus memperhatikan nilai TM primer pada saat mendesain primer, karena berkaitan dengan suhu annealing yang optimal. Setelah banyak percobaan, terbukti bahwa 60 derajat adalah nilai TM yang baik. Suhu anil yang rendah dapat dengan mudah menyebabkan amplifikasi non-spesifik, sedangkan suhu anil yang tinggi biasanya menyebabkan efisiensi amplifikasi yang rendah, puncak kurva amplifikasi yang terlambat, dan nilai CT yang tertunda.
Pertanyaan 4: Apakah jumlah sampel yang terkumpul mempengaruhi hasil percobaan?
A4: Tidak. Jelas, semakin banyak sampel yang dikumpulkan, semakin banyak RNA yang diekstraksi, semakin banyak cDNA, dan akan semakin banyak fragmen target. Untuk kuantifikasi absolut, jumlah salinan fragmen target perlu dihitung, dan jumlah sampel yang dikumpulkan pasti akan mempengaruhi hasil eksperimen. Misalnya, deteksi HBV virus hepatitis C dalam darah adalah dengan mendeteksi kandungan HBV dalam jumlah tertentu (1ml) darah.
Untuk kuantifikasi relatif yang biasa digunakan dalam penelitian ilmiah, jumlah sampel tidak ada hubungannya dengan hasil eksperimen, karena kuantifikasi relatif mengacu pada perbandingan antara gen target dan gen referensi. Harap pertimbangkan mereka sebagai fragmen hulu dan hilir yang ada dalam untai asam nukleat yang sama. Jika ukuran sampel besar, gen referensi dan target meningkat dalam proporsi yang sama pada waktu yang sama, yang tidak mempengaruhi hasil.
Q5: Apakah efisiensi reverse transcriptase mempengaruhi hasil percobaan?
A5: Sama seperti di atas. Perhatikan bahwa kami menginginkan efisiensi RT yang lebih tinggi, tetapi kami lebih suka enzim RT relatif stabil dan mendapatkan hasil yang seragam. Ini akan menjadi ujian kemampuan yang dioptimalkan dari rangkaian transkripsi balik perusahaan besar.
Pertanyaan 6: Apakah efisiensi enzim TAQ mempengaruhi hasil percobaan?
A6: Efisiensi enzim TAQ relatif besar. Biasanya, enzim taq hot-start diperlukan dan relatif efisien. Untuk kit kuantitatif fluoresensi komersial, setiap pabrikan akan mengoptimalkan efisiensi keadaan terbaik menurut produk mereka sendiri mendekati 100 persen , jika efisiensinya terlalu rendah, hasil percobaan tidak dapat diperoleh. Untuk produk perusahaan yang berbeda, ini adalah ukuran kualitas.
Pertanyaan 7: Apakah jumlah pewarna fluoresen mempengaruhi hasil percobaan?
A7: Ya, itu akan. Jika fluorokrom terlalu jenuh, dapat menyebabkan gangguan derau pada beberapa instrumen. Jika fluorokrom tidak jenuh, dan nilai fluoresensi terlalu rendah, ia akan memasuki fase dataran tinggi lebih awal dan kurva amplifikasi akan menjadi datar. Dalam percobaan kuantitatif fluoresensi, nilai CT terutama terlihat, jadi tidak penting untuk kurva amplifikasi akhir untuk memasuki tahap dataran tinggi, tetapi gambarnya tidak cukup indah. Jika harus memilih, mulailah dengan memilih fluorochrome yang sedikit kurang jenuh. Namun, ketika menggunakan produk yang sama dari perusahaan yang sama, pengaruhnya pada dasarnya dapat diabaikan.
Pertanyaan 8: Apakah transmisi tabung PCR akan mempengaruhi hasil percobaan?
A8: Ya. Namun, untuk kumpulan bahan habis pakai yang sama dari pabrikan yang sama, efek ini dapat diabaikan. Ini adalah pilihan yang baik dan yang terbaik adalah menggunakan pelat sumur 96-dengan membran permeabilitas tinggi untuk meminimalkan efek transmisi cahaya bahan habis pakai.
T9: Apakah kesalahan selama pengoperasian akan memengaruhi hasil eksperimen?
A9: Pengaruh proses operasi terutama tercermin dalam keseragaman. Homogenitas berarti bahwa semua komponen dalam sistem dicampur secara merata, dan sentrifugasi flash dapat mengatasi masalah ini. Selain itu, untuk pemula, sebaiknya sesuaikan sistem PCR menjadi lebih dari 20 inci, dan sistem yang terlalu kecil lebih rentan terhadap kesalahan. Jika suhu anil dioptimalkan dengan benar, efek konsentrasi primer pada CT diminimalkan. Dan Anda akan tahu bahwa beberapa kesalahan operasional (seperti konsentrasi primer) dapat dihindari dengan mengoptimalkan suhu anil.
Meringkaskan
Di atas adalah beberapa pertanyaan dan pertanyaan yang sering dihadapi para pemula selama percobaan, kami harap pertanyaan ini dapat membantu Anda memecahkan beberapa kebingungan. Eksperimen adalah proses menghasilkan kekacauan dan memecahkan masalah, semoga Anda mendapatkan sesuatu darinya. Terima kasih telah membaca dan sampai jumpa lagi!