Hari ini, mari kita bicara tentang elemen kunci dalam eksperimen PCR - bahan habis pakai. Sebagai pengunjung PCR yang sering, perlu untuk memahami karakteristik dan terminologi yang terkait dengan bahan habis pakai PCR.
Ada berbagai macam bahan habis pakai PCR di pasaran, termasuk merek, spesifikasi, warna, dll., Yang mempesona. Mari kita pahami langkah demi langkah.
piring pcr
1. Bahan
Biasanya bahan baku consumables PCR adalah polypropylene. Ini adalah bahan lembam tahan panas yang baik. Kisaran suhu kerja adalah -30 hingga 140 derajat , yang memungkinkannya menahan perubahan energi panas selama siklus termal reaksi PCR, dan memainkan peran yang baik dalam menyegel dan melindungi zat dalam sistem reaksi PCR.
Pelajari lebih lanjut tentang polipropilena
2. Warna
Yang umum adalah tabung putih dan tabung PCR transparan. Dalam percobaan PCR tradisional, tidak ada perbedaan antara keduanya. Namun, dalam percobaan waktu-nyata/qPCR yang sama, tabung putih relatif lebih sensitif dan konsisten untuk instrumen qPCR dengan pembacaan sinyal apikal (lihat Gambar A dan B di bawah). kenapa seperti ini?
tabung pcr
A: nilai Ct yang lebih rendah untuk tabung putih dibandingkan dengan tabung bening; B: pengulangan yang lebih baik dengan tabung putih.
Data inti qPCR adalah nilai Ct, dan sinyal fluoresensi adalah sumber data untuk menghitung nilai Ct, jadi sangat penting apakah fluoresensi dalam tabung dapat ditransmisikan sepenuhnya ke detektor. Dinding tabung putih mencegah fluoresensi melewati dinding tabung dan membias (Gambar A di bawah), sehingga mencegah fluoresensi ditransmisikan ke blok pemanas (yaitu, dinding lubang logam tempat tabung ditempatkan) dan diserap atau tidak konsisten tercermin oleh blok. Sinyal fluoresen yang lebih kuat dan lebih pekat dikumpulkan di ujung tabung putih dibandingkan dengan tabung bening (Gambar B di bawah).
tabung pcr
A: Tren perubahan sinyal fluoresensi dalam tabung transparan dan tabung putih; B: Perbandingan intensitas fluoresensi setelah menambahkan jumlah fluorescein yang sama.
Jadi jika Anda menggunakan instrumen qPCR pembacaan atas, coba tabung putih.
3. Kualitas (Lean atau Tidak Lean)
Pentingnya kualitas konsumsi ditekankan di sini. bahan habis pakai qPCR harus bebas dari kontaminan dan penghambat. Tekanan tinggi dan radiasi menghilangkan bakteri dan DNase, tetapi bukan debu dan residu DNA, yang dapat menghambat reaksi PCR atau menghasilkan amplifikasi nonspesifik. Zat memiliki daya serap, dan bahkan polutan kecil pun akan menyerap fluoresensi dalam sistem reaksi dan memengaruhi pengumpulan sinyal fluoresensi. Versi eksperimen yang dibesar-besarkan digunakan untuk mendemonstrasikan pengaruh kontaminasi pengotor pada eksperimen. Seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah, pengotor ditempatkan di salah satu sumur reaksi oktaf. Seperti yang diharapkan, kurva amplifikasi menunjukkan anomali yang ditandai.
Kotoran dalam tabung reaksi PCR
↑ Kotoran dalam tabung reaksi
8 strip
^ Hasil reaksi berulang untuk 8 tabung, pengotor sumur kiri "menyimpang" kurva.
Pengingat: Berhati-hatilah agar bahan habis pakai tidak terpapar udara dalam waktu lama. Setelah mengeluarkan bahan habis pakai, pastikan untuk menutup kantong kemasan dengan cepat agar tidak menyentuhnya dengan tangan kosong. Jika memungkinkan, kerjakan bangku yang bersih.
4. Kapasitas / Ukuran / Fluks
Volume menentukan berapa banyak sampel (volume reaksi) yang dapat dimuat. Overdosis dapat mengakibatkan berkurangnya efisiensi perpindahan panas, tumpahan, atau kontaminasi silang; underdosis dapat mengakibatkan hilangnya sampel evaporatif. Blok pemanas instrumen qPCR juga akan menentukan bahan habis pakai yang berlaku dan ukuran sistem reaksi yang berlaku. Throughput mudah dipahami, ini adalah jumlah maksimum sampel yang dapat dimuat dalam satu percobaan. Kapasitas umum dan spesifikasi fluks ditunjukkan pada tabel di bawah ini:
Tabung tunggal/delapan baris {{0}}.2mL, 0,1mL
{{0}}piring sumur 0.2mL, 0.1mL
{{0}}piring sumur 0,2mL
Spesifikasi kapasitas juga umumnya dibagi menjadi tipe standar dan rendah, seperti yang ditunjukkan di bawah ini. Bahan habis pakai profil rendah memiliki ketinggian yang lebih rendah. Desain pendek ini meminimalkan ruang di atas sistem reaksi ("volume mati" - bagian yang tidak berguna), mengurangi efek penguapan selama siklus termal, dan memungkinkan modul pemanas membungkusnya lebih jauh untuk Meningkatkan efisiensi perpindahan panas. Oleh karena itu, tabung profil rendah juga dikenal sebagai tabung atau pelat "cepat".
tabung pcr
Peringatan: Volume reaksi yang umum digunakan adalah 20 µL, dan disarankan untuk menggunakan tabung reaksi volume kecil 0,1 mL atau volume kecil.
5. Ketebalan dinding
Ketebalan dinding tabung secara langsung mempengaruhi konduktivitas termal. Bahan habis pakai PCR harus memiliki ketebalan dinding yang seragam untuk memberikan perpindahan panas yang konsisten. Dinding tabung ultra tipis 50 persen lebih tipis dari versi standar, yang selanjutnya mengurangi penghalang termal dan memberikan efek respons yang lebih cepat dan lebih baik. Oleh karena itu, untuk memaksimalkan efisiensi reaksi PCR dan memastikan reaksi yang stabil dan efisien, bahan habis pakai PCR yang seragam dan sangat tipis adalah pilihan terbaik.
6. Transparansi
Penutup dan film penyegel untuk qPCR memerlukan kejernihan optik yang tinggi untuk memastikan penetrasi dan transmisi sinyal fluoresen yang optimal sekaligus mengurangi distorsi (untuk instrumen qPCR pembacaan atas). Semakin tinggi transparansi dinding tabung, maka dapat mempengaruhi hasil percobaan. Alasannya sudah dijelaskan di atas. PCR tradisional dapat mengabaikan fitur ini.
7. Rok
Rok pelat PCR mengacu pada perpanjangan periferal pelat. Saat membangun sistem reaksi, skirt berfungsi sebagai penopang yang stabil untuk proses pemipetan dan memberikan kekuatan dan pegangan mekanis saat digabungkan dengan stasiun kerja otomatis. Ada tiga jenis rok yang umum, rok setengah dan rok penuh (sesuai dengan A, B, dan C pada gambar di bawah).
Tanpa rok: Dapat digunakan dengan sebagian besar instrumen PCR atau qPCR, tetapi tidak untuk aplikasi otomatis. Mudah dipindahkan selama pemipetan, tidak terlalu stabil, perlu digunakan dengan dudukan pelat.
Setengah Rok: Ideal untuk aplikasi otomatis dengan stabilitas pemipetan yang baik.
Pelat Rok Penuh: Ideal untuk aplikasi otomatis. Kekuatan mekanik yang baik, cocok untuk instrumen PCR dengan modul menonjol, stabilitas tinggi selama pemipetan.
piring pcr
Tip: Pentingnya rok lebih untuk memfasilitasi industrialisasi dan pemrosesan batch otomatis, dikombinasikan dengan lengan robot. Ini mungkin tidak diperlukan di laboratorium penelitian tradisional, tidak ada rok yang cukup.
piring pcr
8. Parafilm
Film penyegel pelat PCR terbuat dari plastik bening atau aluminium foil. Film transparan perekat lebih umum, cocok untuk 96 atau 384 pelat sumur, dan harus memiliki transmisi cahaya yang cukup baik. Saat menyegel film, sebuah kartu kecil akan digunakan untuk menekan film di sekitar lubang penyegelan untuk menghindari kebocoran udara.
Film aluminium berperekat mungkin kurang umum. Meskipun tidak cocok untuk qPCR, ini adalah bahan habis pakai yang ideal untuk sampel yang peka terhadap cahaya. Karena dapat dilubangi, memudahkan transfer sampel pada PCR (untuk PCR konvensional).
Film penyegelan pelat PCR
Meringkaskan
Sebagai pembawa sistem PCR, bahan habis pakai sangat penting untuk meningkatkan kualitas data eksperimen. Saya harap sharing ini dapat membantu Anda memahami beberapa tips tentang bahan habis pakai PCR dan memberikan bantuan untuk pemilihan bahan habis pakai yang lebih baik.