1. Di dalam cawan kultur, rendam slide yang telah didaki dengan PBS sebanyak tiga kali masing-masing selama 3 menit.
2. Perbaiki slide dengan paraformaldehyde 4 persen selama 15 menit, dan rendam slide dalam PBS sebanyak 3 kali, masing-masing 3 menit.
3. Permeabilisasi dengan 0.5 persen Triton X-100 (disiapkan dalam PBS) selama 20 menit pada suhu kamar (untuk antigen yang diekspresikan pada membran sel, langkah ini dihilangkan).
4. Pemblokiran serum: rendam slide dalam PBS selama 3 kali selama 3 menit setiap kali, keringkan PBS dengan kertas penyerap, tambahkan serum kambing normal (asalkan sumber antibodi sekunder adalah kambing) pada slide, dan blok pada suhu kamar selama 30 menit.
5. Tambahkan antibodi primer: Serap larutan pemblokiran dengan kertas penyerap, jangan dicuci, tambahkan antibodi primer encer dalam jumlah yang cukup ke setiap slide dan masukkan ke dalam kotak basah, inkubasi pada suhu 4 derajat semalam.
6. Tambahkan antibodi sekunder fluoresen: rendam slide dalam PBST selama 3 kali, setiap kali 3 menit, serap kelebihan cairan pada slide dengan kertas penyerap, tambahkan antibodi sekunder fluoresen yang diencerkan tetes demi tetes, inkubasi pada 20-37 derajat selama 1 jam dalam kotak basah, rendam dalam PBST Slice 3 kali, masing-masing 3 menit.
Catatan: Dari penambahan antibodi sekunder fluoresen, semua langkah selanjutnya harus dilakukan di tempat gelap sebanyak mungkin.
7. Pemblokiran serum: hapus cairan dengan kertas penyerap, teteskan serum kambing normal pada kaca objek (asalkan sumber antibodi sekunder adalah kambing), dan blok pada suhu kamar selama 30 menit.
8. Tambahkan antibodi primer: Serap larutan pemblokiran dengan kertas penyerap, jangan dicuci, lalu tambahkan antibodi primer yang telah diencerkan, dan inkubasi semalaman dalam kotak lembab 4 derajat dalam gelap setelah menambahkan antibodi primer. (Catatan: spesies antibodi primer kedua berbeda dengan spesies antibodi primer pertama, seperti tikus dan kelinci)
9. Tambahkan antibodi sekunder fluoresen: rendam slide dalam PBST selama 3 kali, setiap kali 3 menit, serap kelebihan cairan pada slide dengan kertas penyerap, tambahkan antibodi sekunder fluoresen yang telah diencerkan tetes demi tetes, inkubasi pada 20-37 derajat selama 1 jam dalam kotak basah, rendam dalam PBST Slice 3 kali, masing-masing 3 menit. (Catatan: Jika fluoresensi merah dipilih untuk mendeteksi antibodi pertama, yang kedua harus memilih warna fluoresensi lain)
10. Inti Counterstaining: DAPI ditambahkan tetes demi tetes dan diinkubasi dalam gelap selama 5 menit, spesimen diwarnai, dan kelebihan DAPI dicuci dengan PBST 5 menit × 4 kali.
11. Keringkan cairan pada kaca objek dengan kertas penyerap, tutup kaca objek dengan cairan pemasangan yang mengandung peredam antifluoresensi, dan amati serta kumpulkan gambar di bawah mikroskop fluoresensi.
