1. Pemulihan sel
Setelah sel cryopreserved dikeluarkan dari nitrogen cair, mereka dicairkan dengan pengocokan konstan dalam penangas air 37 derajat. Pindahkan sel yang telah dicairkan ke dalam tabung sentrifus, tambahkan media lengkap DMEM yang telah dihangatkan sebelumnya pada suhu 37 derajat (di mana serum janin sapi sekitar 10 persen), tiup perlahan secara merata, sentrifus pada 500 g selama 2 menit, dan buang supernatannya.
Tambahkan media lengkap DMEM untuk mencuci dan membuang supernatan. Tambahkan media lengkap DMEM, campur perlahan dengan pipet, buat suspensi sel, inokulasikan dalam cawan petri/labu, dan biakan dalam inkubator sel yang mengandung 5 persen CO2.
2. Bagian sel
Ketika kepadatan sel mencapai 80 persen ~ 90 persen (hasil prematur tidak mencukupi, sel terlambat dalam kondisi buruk, subkultur dengan rasio 1: 2 hingga 1:10 atau lebih, umumnya generasi sel 1: 3 hingga 1: 5, yaitu, dari inokulasi sel Pada saat pemisahan dan penanaman kembali, media lengkap dihilangkan dan dicuci dua kali dengan 1X PBS.
Tambahkan trypsin (catatan: jumlah larutan pencernaan paling baik untuk menutupi sel, dan suhu pencernaan optimal adalah 37 derajat. Amati sel di bawah mikroskop: amati sel yang dicerna di bawah mikroskop terbalik, jika sitoplasma ditarik kembali, sel tidak lagi terhubung bersama. Irisan, menunjukkan bahwa sel dicerna dengan benar saat ini), cerna, dan tempatkan dalam inkubator sel selama sekitar 2-3 menit.
Tambahkan media lengkap DMEM dalam jumlah yang sesuai untuk menghentikan trypsinization, pindahkan ke tabung centrifuge dan centrifuge pada 500 g selama 2 menit, buang supernatan, tambahkan media lengkap DMEM untuk dicuci, dan buang supernatan.
Tambahkan media lengkap DMEM, campur dengan pipet perlahan, pipet 10 mikroliter untuk dihitung, lalu lanjutkan kultur dalam inkubator sel berisi 5 persen CO2 sesuai volume sel yang dibutuhkan.
3. Kriopreservasi sel
Saat kerapatan sel mencapai 80 persen ~90 persen , keluarkan seluruh media dan cuci 2 kali dengan 1X PBS. Tambahkan trypsin untuk pencernaan dan tempatkan di inkubator sel selama sekitar 2-3 menit. Tambahkan media lengkap DMEM untuk menghentikan pencernaan trypsin, pindahkan ke tabung sentrifus dan sentrifus pada 500 g selama 2 menit, buang supernatan, tambahkan media lengkap DMEM untuk dicuci, dan buang supernatan. Tambahkan 1ml larutan pembekuan (90 persen serum janin sapi, 10 persen DMSO. Secara umum, kandungan serum dapat disesuaikan antara 10 persen dan 90 persen. Menambahkan serum ke larutan pembekuan dapat memberikan nutrisi bagi sel di satu sisi, dan dapat Berikan zat pelindung yang tidak dapat ditembus selama kriopreservasi sel, seperti sukrosa, albumin, dll. Untuk melindungi sel dengan lebih baik), masukkan ke dalam tabung kriopreservasi (ada isopropil alkohol di dalam tabung untuk memastikan kecepatan penurunan suhu), segera masukkan Bekukan dalam lemari es 4 derajat selama 30 menit, lalu masukkan ke dalam lemari es -20 derajat selama 30 menit, lalu masukkan ke dalam lemari es -80 derajat semalaman.
Masukkan ke dalam nitrogen cair keesokan harinya, bisa disimpan minimal dua tahun, dan jika tidak dimasukkan ke dalam nitrogen cair, bisa disimpan selama tiga bulan.
Prinsip kriopreservasi dan pemulihan sel adalah: pembekuan dan pencairan lambat, yang lebih kondusif untuk menjaga viabilitas sel. Kriopreservasi sel tanpa zat pelindung apa pun akan menyebabkan produksi kristal es intraseluler, yang akan menyebabkan kerusakan mekanis endogen pada sel, menyebabkan perubahan tekanan osmotik lingkungan intraseluler, pH, elektrolit, dll., dan kemudian mendorong kematian sel.
4. Hal-hal yang perlu diperhatikan
(1) Memanaskan lebih dulu larutan biakan: masukkan botol yang telah disiapkan yang berisi larutan biakan, PBS dan tripsin ke dalam penangas air 37 derajat untuk dipanaskan terlebih dahulu;
(2) Gunakan alkohol 75 persen untuk menyeka meja kerja ultra-bersih dan tangan yang telah disinari sinar ultraviolet;
(3) Penempatan instrumen bekas yang benar: memastikan ruang operasi yang memadai, yang tidak hanya mudah dioperasikan tetapi juga mengurangi polusi;
(4) Nyalakan lampu alkohol: perhatikan bahwa nyala api tidak boleh terlalu kecil;
(5) Operasi aseptik yang ketat;
(6) Pencernaan sedang sel-sel yang melekat: Waktu pencernaan dipengaruhi oleh banyak faktor seperti jenis larutan pencernaan, waktu persiapan, dan jumlah yang ditambahkan ke labu kultur. Selama proses pencernaan, perhatian harus diberikan pada perubahan bentuk sel yang dikultur. Setelah sitoplasma menyusut, Jika sambungan menjadi longgar, atau ada tanda-tanda mengambang berkeping-keping, pencernaan harus segera diakhiri;
(7) Semua operasi pada sel yang dilalui harus sedekat mungkin dengan nyala lampu alkohol. Yang terbaik adalah bekerja hanya dengan satu sel pada satu waktu, menggunakan satu set peralatan untuk setiap sel. menghindari infeksi silang;
(8) Mulut botol sel yang dilalui perlu disterilkan pada lampu alkohol setiap kali dibuka atau ditutup.
